आणविक निदान, आमतौर पर इस्तेमाल की जाने वाली पीसीआर तकनीक और सिद्धांत

पीसीआर, पोलीमरेज़ श्रृंखला प्रतिक्रिया है, जो डीएनए पोलीमरेज़ के उत्प्रेरण के तहत सिस्टम में dNTP, Mg2+, बढ़ाव कारकों और प्रवर्धन वृद्धि कारकों को जोड़ने को संदर्भित करता है, मूल डीएनए को टेम्पलेट के रूप में और विशिष्ट प्राइमरों को विस्तार के शुरुआती बिंदु के रूप में उपयोग करता है। विकृतीकरण, एनीलिंग, विस्तार आदि के चरणों के माध्यम से, इन विट्रो में मूल स्ट्रैंड टेम्पलेट डीएनए के पूरक बेटी स्ट्रैंड डीएनए की प्रतिकृति बनाने की प्रक्रिया इन विट्रो में किसी भी लक्ष्य डीएनए को जल्दी और विशेष रूप से बढ़ा सकती है।

1. हॉट स्टार्ट पीसीआर

पारंपरिक पीसीआर में प्रवर्धन का प्रारंभ समय पीसीआर मशीन को पीसीआर मशीन में डालना नहीं है, और फिर प्रोग्राम प्रवर्धित होना शुरू हो जाता है।जब सिस्टम कॉन्फ़िगरेशन पूरा हो जाता है, तो प्रवर्धन शुरू हो जाता है, जिससे गैर-विशिष्ट प्रवर्धन हो सकता है, और हॉट-स्टार्ट पीसीआर इस समस्या को हल कर सकता है।

हॉट स्टार्ट पीसीआर क्या है?प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार होने के बाद, प्रतिक्रिया के प्रारंभिक हीटिंग चरण या "हॉट स्टार्ट" चरण के दौरान एंजाइम संशोधक को उच्च तापमान (आमतौर पर 90 डिग्री सेल्सियस से अधिक) पर छोड़ा जाता है, ताकि डीएनए पोलीमरेज़ सक्रिय हो जाए।सटीक सक्रियण समय और तापमान डीएनए पोलीमरेज़ और हॉट-स्टार्ट संशोधक की प्रकृति पर निर्भर करता है।यह विधि मुख्य रूप से डीएनए पोलीमरेज़ की गतिविधि को रोकने के लिए एंटीबॉडी, एफ़िनिटी लिगैंड या रासायनिक संशोधक जैसे संशोधक का उपयोग करती है।चूंकि डीएनए पोलीमरेज़ की गतिविधि कमरे के तापमान पर बाधित होती है, इसलिए हॉट स्टार्ट तकनीक पीसीआर प्रतिक्रियाओं की विशिष्टता का त्याग किए बिना कमरे के तापमान पर कई पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली तैयार करने के लिए बड़ी सुविधा प्रदान करती है।

2. आरटी-पीसीआर

आरटी-पीसीआर (रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पीसीआर) एमआरएनए से सीडीएनए में रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन और इसे प्रवर्धन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में उपयोग करने की एक प्रयोगात्मक तकनीक है।प्रायोगिक प्रक्रिया में पहले ऊतकों या कोशिकाओं में कुल आरएनए को निकालना, प्राइमर के रूप में ओलिगो (डीटी) का उपयोग करना, सीडीएनए को संश्लेषित करने के लिए रिवर्स ट्रांसक्रिपटेस का उपयोग करना और फिर लक्ष्य जीन प्राप्त करने या जीन अभिव्यक्ति का पता लगाने के लिए पीसीआर प्रवर्धन के लिए एक टेम्पलेट के रूप में सीडीएनए का उपयोग करना है।

3. फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर

फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर (वास्तविक समय मात्रात्मक पीसीआर,आरटी-क्यूपीसीआर) पीसीआर प्रतिक्रिया प्रणाली में फ्लोरोसेंट समूहों को जोड़ने की विधि को संदर्भित करता है, वास्तविक समय में संपूर्ण पीसीआर प्रक्रिया की निगरानी के लिए फ्लोरोसेंट संकेतों के संचय का उपयोग करता है, और अंत में टेम्पलेट का मात्रात्मक विश्लेषण करने के लिए मानक वक्र का उपयोग करता है।आम तौर पर इस्तेमाल की जाने वाली क्यूपीसीआर विधियों में एसवाईबीआर ग्रीन I और टैकमैन शामिल हैं।

4. नेस्टेड पीसीआर

नेस्टेड पीसीआर पीसीआर प्रवर्धन के दो दौरों के लिए पीसीआर प्राइमरों के दो सेटों के उपयोग को संदर्भित करता है, और दूसरे दौर का प्रवर्धन उत्पाद लक्ष्य जीन टुकड़ा है।

यदि प्राइमरों (बाहरी प्राइमरों) की पहली जोड़ी के बेमेल होने के कारण एक गैर-विशिष्ट उत्पाद प्रवर्धित हो जाता है, तो उसी गैर-विशिष्ट क्षेत्र की प्राइमरों की दूसरी जोड़ी द्वारा पहचाने जाने और प्रवर्धन जारी रखने की संभावना बहुत कम है, इसलिए प्राइमरों की दूसरी जोड़ी द्वारा प्रवर्धन, पीसीआर की विशिष्टता में सुधार किया गया है।पीसीआर के दो राउंड करने का एक फायदा यह है कि यह सीमित शुरुआती डीएनए से पर्याप्त उत्पाद को बढ़ाने में मदद करता है।

5. टचडाउन पीसीआर

टचडाउन पीसीआर पीसीआर चक्र मापदंडों को समायोजित करके पीसीआर प्रतिक्रिया की विशिष्टता में सुधार करने की एक विधि है।

टचडाउन पीसीआर में, पहले कुछ चक्रों के लिए एनीलिंग तापमान प्राइमर के अधिकतम एनीलिंग तापमान (टीएम) से कुछ डिग्री ऊपर सेट किया जाता है।उच्च एनीलिंग तापमान गैर-विशिष्ट प्रवर्धन को प्रभावी ढंग से कम कर सकता है, लेकिन साथ ही, उच्च एनीलिंग तापमान प्राइमरों और लक्ष्य अनुक्रमों के पृथक्करण को बढ़ा देगा, जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर उपज कम हो जाएगी।इसलिए, पहले कुछ चक्रों में, सिस्टम में लक्ष्य जीन की सामग्री को बढ़ाने के लिए एनीलिंग तापमान आमतौर पर प्रति चक्र 1 डिग्री सेल्सियस कम करने के लिए निर्धारित किया जाता है।जब एनीलिंग तापमान इष्टतम तापमान तक कम हो जाता है, तो एनीलिंग तापमान शेष चक्रों के लिए बनाए रखा जाता है।

6. डायरेक्ट पीसीआर

डायरेक्ट पीसीआर न्यूक्लिक एसिड अलगाव और शुद्धिकरण की आवश्यकता के बिना सीधे नमूने से लक्ष्य डीएनए के प्रवर्धन को संदर्भित करता है।

प्रत्यक्ष पीसीआर दो प्रकार के होते हैं:

प्रत्यक्ष विधि: थोड़ी मात्रा में नमूना लें और पीसीआर पहचान के लिए इसे सीधे पीसीआर मास्टर मिक्स में जोड़ें;

क्रैकिंग विधि: नमूना लेने के बाद, इसे लाइसेट में जोड़ें, जीनोम को मुक्त करने के लिए लाइसे, थोड़ी मात्रा में लाइज्ड सतह पर तैरनेवाला लें और इसे पीसीआर मास्टर मिक्स में जोड़ें, पीसीआर पहचान करें।यह दृष्टिकोण प्रायोगिक कार्यप्रवाह को सरल बनाता है, व्यावहारिक समय को कम करता है, और शुद्धिकरण चरणों के दौरान डीएनए हानि से बचाता है।

7. एसओई पीसीआर

ओवरलैप एक्सटेंशन द्वारा जीन स्प्लिसिंग पीसीआर (एसओई पीसीआर) पीसीआर उत्पादों को ओवरलैपिंग चेन बनाने के लिए पूरक सिरों वाले प्राइमरों का उपयोग करता है, ताकि बाद में प्रवर्धन प्रतिक्रिया में, ओवरलैपिंग चेन के विस्तार के माध्यम से, ए तकनीक के विभिन्न स्रोत जिसमें प्रवर्धित टुकड़े ओवरलैप हो जाते हैं और एक साथ जोड़ा गया।इस तकनीक की वर्तमान में दो मुख्य अनुप्रयोग दिशाएँ हैं: संलयन जीन का निर्माण;जीन साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन।

8. आईपीसीआर

उलटा पीसीआर (आईपीसीआर) दो प्राइमरों के अलावा अन्य डीएनए टुकड़ों को बढ़ाने के लिए रिवर्स पूरक प्राइमरों का उपयोग करता है, और ज्ञात डीएनए टुकड़े के दोनों तरफ अज्ञात अनुक्रमों को बढ़ाता है।

आईपीसीआर मूल रूप से आसन्न अज्ञात क्षेत्रों के अनुक्रम को निर्धारित करने के लिए डिज़ाइन किया गया था, और इसका उपयोग ज्यादातर जीन प्रमोटर अनुक्रमों का अध्ययन करने के लिए किया जाता है;ऑन्कोजेनिक क्रोमोसोमल पुनर्व्यवस्था, जैसे जीन संलयन, ट्रांसलोकेशन और ट्रांसपोज़िशन;और वायरल जीन एकीकरण भी अब आमतौर पर उपयोग किया जाता है। साइट-निर्देशित उत्परिवर्तन के लिए, वांछित उत्परिवर्तन के साथ एक प्लास्मिड की प्रतिलिपि बनाएँ।

9. डीपीसीआर

डिजिटल पीसीआर (डीपीसीआर) न्यूक्लिक एसिड अणुओं की पूर्ण मात्रा का ठहराव के लिए एक तकनीक है।

न्यूक्लिक एसिड अणुओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए वर्तमान में तीन विधियाँ हैं।फोटोमेट्री न्यूक्लिक एसिड अणुओं के अवशोषण पर आधारित है;वास्तविक समय फ्लोरोसेंट मात्रात्मक पीसीआर (रियल टाइम पीसीआर) सीटी मान पर आधारित है, और सीटी मान फ्लोरोसेंस मान के अनुरूप चक्र संख्या को संदर्भित करता है जिसे पता लगाया जा सकता है;डिजिटल पीसीआर न्यूक्लिक एसिड मात्रा की गणना के लिए एकल-अणु पीसीआर विधि पर आधारित नवीनतम मात्रात्मक तकनीक है, जो एक पूर्ण मात्रात्मक विधि है।