अल्ट्राफिल्ट्रेशन सेंट्रीफ्यूज ट्यूब का उपयोग और सावधानियां
1) एक उपयुक्त अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब चुनें।ध्यान दें कि यूएफ झिल्ली विभिन्न रसायनों के प्रति सहनशीलता के स्तर में भिन्न होती है।आमतौर पर, 10 केडीए आणविक भार कट-ऑफ के साथ अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबों को आणविक भार कट-ऑफ के साथ चुना जा सकता है जो कि रुचि के प्रोटीन के आणविक भार के 1/3 से अधिक नहीं होना चाहिए, जैसे कि 35 केडीए।यदि रुचि के प्रोटीन का आणविक भार लगभग 10 kd है, तो 3 KD के आणविक भार कट-ऑफ के साथ एक अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब का उपयोग किया जा सकता है।
(2) ताजा खरीदा गया अल्ट्राफिल्ट्रेशन सूखा होता है, जिसमें उपयोग से पहले अल्ट्राप्योर पानी मिलाया जाता है और पानी पूरी तरह से झिल्ली, बर्फ के स्नान या कुछ मिनटों के लिए पहले से ठंडा किए गए रेफ्रिजरेटर से गुजर जाता है।फिर पानी डाला जाता है, यानी प्रोटीन तरल, और कितना जोड़ा जाता है, जो भी ट्यूब के शीर्ष पर सफेद रेखा से अधिक नहीं होता है।ऑपरेशन हल्का है, और प्रोटीन समाधान जोड़ने से पहले अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब को बर्फ पर पहले से ठंडा करने की आवश्यकता होती है।
3) द्रव्यमान और गुरुत्वाकर्षण केंद्र दोनों को संतुलन तक पहुंचना था।ध्यान दें कि घूर्णी गति और त्वरण बहुत तेज़ नहीं हैं, अन्यथा सीधे अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली को नुकसान पहुंचाते हैं।केन्द्रापसारक अल्ट्राफिल्ट्रेशन शुरू किया गया (सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री तक पहले से ठंडा किया गया)।विभिन्न सेंट्रीफ्यूज के आरपीएम को जी में परिवर्तित करने के बाद, यह अलग था।अपकेंद्रित्र के त्वरण को न्यूनतम पर समायोजित किया गया, जिससे झिल्ली पर दबाव कम हो गया।ध्यान दें, सेंट्रीफ्यूज के अपनी गंतव्य गति तक पहुंचने के बाद इसे छोड़ना सुनिश्चित करें, अन्यथा यदि आपको कोई समस्या है, तो आप इसे पहली बार संभाल नहीं पाएंगे।स्पिंडल की ओर झिल्ली का उन्मुखीकरण निर्देशों के अनुसार समायोजित किया गया था (कोणीय सेंट्रीफ्यूज केस झिल्ली से अक्ष के लंबवत है)।व्यावहारिक उपयोग में, सामान्य घूर्णन गति निर्देशों की तुलना में कम है, ताकि अपकेंद्रित्र ट्यूब का जीवन बढ़ाया जा सके।
3) द्रव्यमान और गुरुत्वाकर्षण केंद्र दोनों को संतुलन तक पहुंचना था।ध्यान दें कि घूर्णी गति और त्वरण बहुत तेज़ नहीं हैं, अन्यथा सीधे अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली को नुकसान पहुंचाते हैं।केन्द्रापसारक अल्ट्राफिल्ट्रेशन शुरू किया गया (सेंट्रीफ्यूज को 4 डिग्री तक पहले से ठंडा किया गया)।विभिन्न सेंट्रीफ्यूज के आरपीएम को जी में परिवर्तित करने के बाद, यह अलग था।अपकेंद्रित्र के त्वरण को न्यूनतम पर समायोजित किया गया, जिससे झिल्ली पर दबाव कम हो गया।ध्यान दें, सेंट्रीफ्यूज के अपनी गंतव्य गति तक पहुंचने के बाद इसे छोड़ना सुनिश्चित करें, अन्यथा यदि आपको कोई समस्या है, तो आप इसे पहली बार संभाल नहीं पाएंगे।स्पिंडल की ओर झिल्ली का उन्मुखीकरण निर्देशों के अनुसार समायोजित किया गया था (कोणीय सेंट्रीफ्यूज केस झिल्ली से अक्ष के लंबवत है)।व्यावहारिक उपयोग में, सामान्य घूर्णन गति निर्देशों की तुलना में कम है, ताकि अपकेंद्रित्र ट्यूब का जीवन बढ़ाया जा सके।
(4) शेष 1 मिलीलीटर तक सांद्रित होने पर, 50 ul बफर समाधान लें, 10 ul प्रवाह डालें और देखें कि क्या कोई नीला रंग है, यह निर्णय के रूप में कि अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब में प्रोटीन गायब है या नहीं।यदि ट्यूब लीक हो रही है, तो अल्ट्राफिल्ट्रेशन शुरू करने के लिए ऊपरी परत को फिर से डालें और एक नई ट्यूब में प्रवाहित करें।सटीक रूप से यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ट्यूब छूट गई हैं, प्रवाह से पहले बीएसए के 5 मिलीग्राम एमएल के साथ 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, प्रोटीन गोंद, या ब्रैडफोर्ड क्रूड परख पर चलाएं, और शेष केंद्रित प्रोटीन समाधान (जो बर्फ पर संचालित होता है और प्रोटीन को गर्म होने से रोकता है) जोड़कर जारी रखें। सारा सांद्रण जोड़ दिया गया है।सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान सावधानी बरतें यदि प्रोटीन का अवक्षेपण होता है, जिससे ट्यूब बंद हो जाती है।यदि वर्षा होती है, तो निर्धारित करें कि वर्षा का विशिष्ट कारण अत्यधिक प्रोटीन सांद्रता या अनुचित बफर है;पहले को एक साथ कई अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबों के अल्ट्राफिल्ट्रेशन द्वारा हल किया जा सकता है, जिससे एकाग्रता कम हो जाती है, और बाद वाले को अलग-अलग बफर समाधानों का आदान-प्रदान करके तब तक हल किया जा सकता है जब तक कि प्रोटीन की कोई वर्षा न हो जाए।
(4) शेष 1 मिलीलीटर तक सांद्रित होने पर, 50 ul बफर समाधान लें, 10 ul प्रवाह डालें और देखें कि क्या कोई नीला रंग है, यह निर्णय के रूप में कि अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूब में प्रोटीन गायब है या नहीं।यदि ट्यूब लीक हो रही है, तो अल्ट्राफिल्ट्रेशन शुरू करने के लिए ऊपरी परत को फिर से डालें और एक नई ट्यूब में प्रवाहित करें।सटीक रूप से यह निर्धारित करने के लिए कि क्या ट्यूब छूट गई हैं, प्रवाह से पहले बीएसए के 5 मिलीग्राम एमएल के साथ 10 मिनट के लिए सेंट्रीफ्यूज करें, प्रोटीन गोंद, या ब्रैडफोर्ड क्रूड परख पर चलाएं, और शेष केंद्रित प्रोटीन समाधान (जो बर्फ पर संचालित होता है और प्रोटीन को गर्म होने से रोकता है) जोड़कर जारी रखें। सारा सांद्रण जोड़ दिया गया है।सेंट्रीफ्यूजेशन के दौरान सावधानी बरतें यदि प्रोटीन का अवक्षेपण होता है, जिससे ट्यूब बंद हो जाती है।यदि वर्षा होती है, तो निर्धारित करें कि वर्षा का विशिष्ट कारण अत्यधिक प्रोटीन सांद्रता या अनुचित बफर है;पहले को एक साथ कई अल्ट्राफिल्ट्रेशन ट्यूबों के अल्ट्राफिल्ट्रेशन द्वारा हल किया जा सकता है, जिससे एकाग्रता कम हो जाती है, और बाद वाले को अलग-अलग बफर समाधानों का आदान-प्रदान करके तब तक हल किया जा सकता है जब तक कि प्रोटीन की कोई वर्षा न हो जाए।
(5) पहले कुछ चरणों का उपयोग प्रोटीन को केंद्रित करने के लिए किया जाता है, और यदि बफर को बदलना है, तो धीरे-धीरे कुल प्रोटीन के लगभग 1 मिलीलीटर में नया बफर (0.22um अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली के माध्यम से अल्ट्राफिल्ट्रेशन) जोड़ें, और तीन के लिए लगभग 1 मिलीलीटर पर पुन: केंद्रित करें। वांछित प्रोटीन सांद्रता के आधार पर अंतिम संकेंद्रित अंतिम मात्रा के साथ लगातार बार, आम तौर पर 500ul से अधिक नहीं, बल्कि 200ul के भीतर भी।तीन मौकों पर 1000 × या अधिक प्राप्त करें, अनिवार्य रूप से उतना ही बफर परिवर्तन, जितनी हर बार कम से कम 10 × या इतनी मात्रा संवर्धन द्वारा गणना की जाती है।
(5) पहले कुछ चरणों का उपयोग प्रोटीन को केंद्रित करने के लिए किया जाता है, और यदि बफर को बदलना है, तो धीरे-धीरे कुल प्रोटीन के लगभग 1 मिलीलीटर में नया बफर (0.22um अल्ट्राफिल्ट्रेशन झिल्ली के माध्यम से अल्ट्राफिल्ट्रेशन) जोड़ें, और तीन के लिए लगभग 1 मिलीलीटर पर पुन: केंद्रित करें। वांछित प्रोटीन सांद्रता के आधार पर अंतिम संकेंद्रित अंतिम मात्रा के साथ लगातार बार, आम तौर पर 500ul से अधिक नहीं, बल्कि 200ul के भीतर भी।तीन मौकों पर 1000 × या अधिक प्राप्त करें, अनिवार्य रूप से उतना ही बफर परिवर्तन, जितनी हर बार कम से कम 10 × या इतनी मात्रा संवर्धन द्वारा गणना की जाती है।
पोस्ट करने का समय: नवंबर-09-2022